AG真人国际(中国)官方官网细胞凋亡检测技术服务

2016-01-29

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细胞水平分析

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细胞凋亡或称程序性细胞死亡（PCD）是受基因控制的一种主动性细胞自杀过程，在形态学和生化有其明显的特征，是有别于细胞坏死的细胞死亡方式。研究细胞凋亡的方法有很多，如形态学观察，琼脂糖凝胶电泳，原位末端标记法，流式细胞仪检测等。

细胞凋亡检测

细胞凋亡时，形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形，核碎裂；细胞体积变小，细胞浆和细胞器密度增高；线粒体正常或轻微肿胀；细胞膜皱折、卷曲，但早期细胞膜仍保持完整；细胞膜出泡，芽生形成膜包裹的凋亡小体，内含完整的细胞器和核碎片。在组织中，凋亡小体常迅速被邻近细胞吞噬，由于细胞内容物不外溢，故周围组织中无炎症反应。而细胞坏死时，细胞体积变大，线粒体明显肿胀，在早期细胞膜的完整性即被破坏，胞浆内容物外泄，引起局部炎症反应或组织损伤。核的变化发生较晚，主要是核溶解和消失。无凋亡小体形成。

形态学是鉴定细胞凋亡最可靠的方法，主要有普通光学显微镜观察方法，透射电子显微镜观察方法和荧光显微镜观察方法等，以下介绍普通光学显微镜观察方法中的HE染色法以及荧光显微镜观察方法中的吖啶橙染色法和吖啶橙/EB染色法。

细胞凋亡检测

细胞凋亡检测方法

方法一苏木素——伊红染色（HE染色法）
【原理】苏木素容易被氧化，其氧化产物苏木红与铝结合形成一种带正电荷的蓝色色精，与带负电荷的脱氧核糖核酸酸根吸附而使细胞核染色。染色后必须进行分化（differenciation）和蓝化（blueing）处理。所谓分化，就是用某些试剂，将过度染色的或不需着色的组织成分上的颜色除去。所谓蓝化是指用明矾苏木素液深染细胞核后，通过盐酸乙醇分化，切片从酸性环境中（此时，切片呈红褐色）转移至流水中使之变蓝的过程。
伊红Y（四嗅荧光素二钠盐）是一种酸性染料，可使细胞的胞浆染成粉红色。

方法二吖啶橙染色法
【原理】吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可通过与DNA和RNA的连接碱基对和磷酸盐基团结合，使细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。吖啶橙在稀溶液中呈绿色；在浓溶液中，由于出现二聚体和多聚体而呈现橙红色。由于DNA是高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，故发绿色荧光；而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。

方法三吖啶橙/EB双染色法
【原理】用吖啶橙染色可以检测细胞凋亡，但不能区别活细胞和死细胞。溴化乙锭（EB）仅着染死细胞，可使DNA染成桔红色，而仅很弱地结合RNA使之呈红色。因此将吖啶橙和溴化乙锭混合使用，可根据两种染料的吸收情况鉴定死细胞和活细胞。

方法四琼脂糖凝胶电泳法
【原理】在细胞凋亡过程中，内源性核酸内切酶被激活，该酶优先作用于连接DNA的核小体间区域，将DNA链切割成为180～200bp或其整倍数的片段。将这些DNA片段抽提出来进行琼脂糖凝胶电泳，即可出现梯状电泳图谱。坏死细胞的DNA随机降解，并伴组蛋白的降解，故在凝胶电泳时呈模糊、弥散膜状条带。

方法五原位末端标记技术
细胞凋亡中，染色体DNA的断裂是一渐进的分阶段的过程，其首先在内源性核酸水解酶的作用下降解为50~300kbp的DNA大片段。然后大约30%的染色质DNA在Ca2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下，从核小体间将DNA链切割成为180～200bp或其整倍数的寡核苷酸片段。染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，并通过一定的显示系统使之显示出来，从而可对完整的单个凋亡细胞或凋亡小体进行原位染色，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，所以很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学法和DNA ladder测定法要高，且能早期显示尚未发生典型形态变化的凋亡细胞，是检测单个细胞早期出现凋亡现象的较好方法，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
【原理】在TdT酶的作用下，生物素（biotin）标记的dUTP可以参入到凋亡细胞DNA断链的3'-OH末端，并可与连接了过氧化物酶（POD）的亲和素（streptavidin）特异结合，POD可催化底物DAB产生很强的颜色反应，特异准确地定位凋亡细胞，因而在普通光学显微镜下，即可观察和计数凋亡的细胞。

方法六亚G1峰检测法
【原理】处于增殖周期中的细胞，根据其所处不同周期时相（Go/G1、S、G2/M），其DNA含量分布在2n～4n之间。凋亡细胞的重要特点就是细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解。在乙醇固定和去垢剂处理后，凋亡细胞的细胞膜通透性增加，导致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，以DNA特异性荧光染料染色后，形成一个DNA含量小于2n（即小于G0/G1期细胞）的分布区。用流式细胞仪分析，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰（Sub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak, 也叫凋亡峰）。代表凋亡细胞。根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率。

方法七 Annexin V-FITC凋亡检测

【原理】正常活细胞带负电的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。以标记了FITC的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和发生继发坏死的细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。将Annexin Ⅴ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及继发坏死的细胞区分开来。